经常接到客户的一些信息反馈，我的共聚焦图像为什么没有你们拍的好，感觉总是“糊”的。
今天我们列举几个常见原因，看看你是不是可以对症下药；
1.激光功率和增益调节失衡
这个是共聚焦最关键的两个参数，与成像质量强最相关；
这个两个参数调不好，直接导致图像过曝或信噪比太低，进而会导致细节丢失；
我们拍照时，往往为增强弱信号而过度提高激光功率和探测器增益，
提高激光功率会带来光漂白，增益过大会引入噪声；
这里建议大家使用不同品牌的显微镜，先把增益调到厂家的推荐值上，这个推荐值一般就是没有引入噪声的一个标称值，每种探测器不一样，可以咨询厂家；
增益设置好后，再去调整激光功率，这样避免了盲目增大激光功率带来过度的淬灭；
激光功率调整到出现标记蛋白后，再去微调增益，这样就可以避免了盲目增大增益带来的噪声；
经过上面两个步骤就找到了适合自己样本的最佳功率和增益。
2.没有对准焦平面
这个是很多新手容易犯的错误；
在使用共聚焦时一定要先对焦，即使在显微镜下对好了焦面，在共聚焦模式下也要再微调一下；
有些厂家的共聚焦焦面和显微镜焦面不是绝对重合的，所以切换到共聚焦模式下一定要先对焦；
尤其是拍摄薄样本，失焦肯定会带来图像模糊。
3.物镜污染损坏
如果在镜下观察样本时，蛋白就比较模糊，大概率是物镜脏了或者别损坏了；
如果显微镜下观察不清晰，用专用镜头纸和清洁液（一般用无水乙醇）小心清洁物镜；
尤其是油镜，有些同学使用完没有及时擦去油污，很容易造成物镜变脏；
还有一些物镜，如大家最喜欢用的40x物镜，很多是带调整环的，这时候需要根据我们盖玻片的厚度，调整这个校准环到对应的刻度上；
4.培养皿或孔板不匹配
共聚焦显微镜使用的都是平场复消色差APO物镜，镜头设计的一般是匹配0.17mm厚度的盖玻片或皿底；
这个我们普通的盖玻片一般是这个厚度，注意不要放样的时候不要放反就行；
如果使用培养皿或多孔板，一定要选择共聚焦专用的规格，就是皿底0.17mm厚度的；
如果培养皿选择不当，在10x、20x下可能还都能看到样本，在高倍镜下完全找不到；
5.针孔开的太大
激光扫描共聚焦显微镜比荧光显微镜清晰的原因就是引入了针孔，它能帮助更好的滤除非焦平面的杂散光信号，只保留焦平面上的样本信息，这样提升了图像的对比度和清晰度，从而提升了分辨率。
如果针孔开的太大，就失去了这个作业，图像变得更荧光显微镜一样，也会导致图像模糊。
还有很多其它原因导致共聚焦图像模糊，如染色没有做好、封片没有封好、自发荧光等，，这里列举一个自查流程，帮助大家寻找问题。
看整体：是整体模糊，还是局部有污渍？→ 整体模糊进入上面的5个排除法，局部模糊检查物镜是否污染。
看背景：背景是否异常明亮？→ 是，检查针孔和样品自发荧光。
看细节：细节是否呈马赛克？→ 是，提高图像分辨率（像素数）。
看调焦：切换不同焦面，看结构是否清晰？→ 是，确定焦平面没有找准的问题。
用标样：用标准荧光微球测试。→ 仍模糊，基本确定是仪器硬件或校准问题。
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