细胞凋亡前中期会出现细胞膜和细胞质的变化,晚期则细胞核内DNA会出现损伤和断裂,因此可以通过检测DNA的断裂从而反应细胞的凋亡情况。
一、彗星实验
实验原理:
当各种内源性和外源性因素诱发细胞DNA链断裂时,其超螺旋结构受到破坏,在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜等膜结构受到破坏,细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到电解液中,而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。
检测方法:
中性处理:在中性条件下,DNA维持双链构象,因而仅可以检测双链断裂。
碱性处理:在碱性电解质的作用下,DNA发生解螺旋,损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的相对分子质量小且碱变性为单链,所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA向正极迁移形成彗星状图像。
实验操作:
将细胞固定于低熔点琼脂糖中;
用裂解液破坏细胞膜;
再用碱溶液使 DNA 分子解旋;
将载玻片置于电泳液中,在电场的作用下,DNA 分子向阳极移动。
实验结果分析:
如果 DNA 损伤严重,则产生的碎片就越多、越小,向阳极迁移的DNA碎片量就越多,迁移距离也越长,荧光染色后就能看见“彗星”样尾长并且荧光强度增强。
未受损伤的 DNA 大分子则由于细胞膜的阻隔,滞留在原处。
二、实验数据分析
数据处理(以CASP彗星分析软为例)
(1)在拍照时以tif格式保存图片,然后点击下图的绿色框选的位置导入文件。
(2)打开view下拉菜单,选“resultwindow”,在分析后您就可以看到您的结果窗口。
分析之前最好把右侧的head和tail选中,(红色框选部分,这样可以出现头、尾分明的视觉效果,如图Fig2)
(3)用白色画框选中要分析的区域(见Fig3)
(4)图中数字表示
1:翻页
2:分析
3:保存
4:调整背景调整
5:进入正式分析
调整好位置后,开始分析前要点击“5”,然后点“ 2”,再点“ 3 ”,这样一张图的数据就分析完了,数据会保存在系统里。点击“翻页”可以继续分析下一张图。
绿色框选所指区域是分析后的曲线,主曲线图下面列举了几个数据,全部结果在结果窗口。
(5)将分析窗口最小化(点击下图红色框选部分)可以预览分析好的数据
(6)分析完所有图片后导出数据保存成txt格式,保留TailDNA%(尾部DNA百分含量),TailLength(尾长),TailMoment(尾矩)三列数据,下图为细胞展示图。
7)根据彗星尾部荧光强度占总强度的百分比(TailDNA%)将采集的细胞图像分为5个等级。
![5.jpg](/static/upload/image/20250120/1737360966968680.jpg)