盘点 | IHC的9个实验关键点

今天这篇文章，我们分享一下IHC 实验关键点。

IHC 实验流程通常包括样本固定、包埋、切片、抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、酶底物显色或荧光检测、封片观察9个部分。这9个部分是环环相扣，每一步的疏忽都可能导致一无所获。

IHC 实验流程

正确的固定是免疫组织化学方法的关键，免疫组化无法检测一个已经不存在的抗原。很多抗原在离体组织中只存在很短时间，自溶（autolysis）和坏死（necrosis）使得抗原进一步降解，组织形态和结构被破坏。样品浸泡在合适的固定液中，固定液完全渗透组织，使蛋白失去活性，并且使组织被「保存」、稳定在接近 in vivo 状态。

固定溶剂通常分为两种：

①交联试剂——Crosslinking reagents (多聚甲醛，福尔马林等)

· 显色底物的选择，现配现用，避光处理

· 显色底物全覆盖在膜上，避免不均

②有机溶剂——Organic solvents（甲醇，乙醇，丙酮等）

· 有通透作用

· 不推荐用于膜蛋白的检测

样本固定是 IHC 实验最基础也是很关键的一步哦，提醒您以下注意事项：

样本固定时间取决于组织块大小与组织类型，但对于大多数样本，室温固定 18-24 小时较为合适。

固定不充分会导致样本边缘信号较高而中心信号较弱，甚至无信号。

过度固定则会封闭抗原表位，虽然抗原修复会暴露其中一部分表位，但如果组织固定时间非常长（如一周以上），则会发生抗原修复后依然无信号的现象。

根据实验需要，选择合适的包埋剂对样本进行包埋，同时选择合适的切片机进行切片。常见样本包埋方法比较：

对于常见三种切片方法的优劣对比如下：

福尔马林或多聚甲醛固定会导致蛋白交联(亚甲基桥)，从而掩盖抗原表位，限制抗原 - 抗体的结合。抗原修复则会破坏这些亚甲基桥，暴露抗原表位，允许其与抗体结合。

这一解交联的过程称为抗原修复(antigen retrieval)、表位修复(epitope retrieval)或解遮蔽(demasking)。

通常对于石蜡切片，抗原修复必不可少，而冰冻组织切片通常不够牢固 ，进行抗原修复时会损坏切片。一般会避免使用甲醛固定剂固定冷冻切片（或者在使用时大大减少固定时间），从而省去或减少抗原修复需求。

抗原修复通常有两种不同的方法：

酶抗原修复：胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K 等

热抗原修复：高压蒸汽法、微波法、水浴加热法等

酶抗原修复通常会破坏组织的完整性，在一定程度上影响抗原，且修复效率有限，通常适用于冰冻切片，但其操作标准化难度大：酶浓度、反应时间和温度均须根据自己的实验要求进行摸索和优化。

热抗原修复的参数则更可控，但微波炉加热可能会导致抗原修复不均匀，沸水剧烈沸腾可能会导致发生脱片，所以高压蒸汽法是更推荐大家使用的！

好的抗原修复取决于好的抗原修复方法和合适的抗原修复液，而抗原修复液取决于靶抗原所需的 pH值，通常 pH 6.0的 柠檬酸钠修复液较为温和，而pH 9.0 的 Tris-EDTA 修复液则更为剧烈。所以再次提醒大家初次进行 IHC 实验时可以根据产品说明书相应结果选择合适的抗原修复液哦~

对切片进行封闭，是为了阻断抗体抗原之间的非特异结合，降低背景和潜在假阳性染色。

温馨提醒：

如果后续使用 DAB 等 HRP 标记物进行显色反应，那在封闭前一定要记得使用 3% 过氧化氢对内源性的过氧化物酶进行失活处理哦~

免疫染色的成功依赖于靶标抗原特异性结合的一抗，确定最佳或最优的抗体工作浓度，可以使特异性染色最大化并减少背景）。

不同浓度一抗染色结果对比

同时也建议在进行新的 IHC 实验时，使用新鲜抗体，避免重复利用。不熟悉抗体稀释度的小伙伴也可以根据相应产品说明书推荐的起始浓度进行尝试。

IHC 实验既可以使用酶标二抗进行后续显色反应，也可以使用荧光二抗进行成像观察。

酶标与荧光二抗示意图

根据个人经验，在 IHC 实验中使用 Polymer 藕连的二抗对信号进行放大），会得到更漂亮的实验结果哦~

聚合物藕连二抗信号放大示意图

除此之外，不管是一抗还是二抗孵育，也希望您能关注以下两点：

建议在湿盒中进行抗体孵育，防止发生干片现象。

如果实验允许，请同时进行只加二抗不加一抗的对照实验。

二抗孵育完成，对切片进行充分清洗后，可以通过酶底物进行显色或荧光进行检测。常见的酶底物方法，包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）显示颜色如下：

_{常见的酶底物方法显示颜色}

显色完成后，通常会使用苏木素或伊红进行复染，以更好的指示细胞核或其它结构。复染完成后，在切片上滴加中性树脂或防荧光淬灭封片剂，在切片上盖上玻片来保护和保存切片。

对于使用荧光二抗进行 IHC 实验的小伙伴，温馨提醒，实验完成后请尽快完成共聚焦显微镜观察，这样才能获得漂亮清晰的实验结果哦~

IHC 实验结果图：酶底物显色（左）和荧光检测（右）