1. 前言
非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明确肝损伤因素，以肝细胞弥漫性脂肪变性为主要特征的慢性肝脏疾病。NAFLD的疾病谱包括非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL），非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），进而可发展为肝硬化，甚至肝细胞癌。
NAFLD是全球范围内的主要肝脏疾病之一，其患病率约为25%。单纯NAFL患者发生不良后果的风险很低，而一旦进展为NASH，发生肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌的风险将大大增加。
2. 方法与材料
本文以Hepa1-6小鼠肝癌细胞系为例，采用油酸钠、棕榈酸钠（KC006，Kunchuang Biotechnology）作为游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）在Hepa1-6小鼠肝癌细胞系中构建了肝脏脂肪变性细胞模型，完成体外细胞实验。
在众多国内外研究中，NAFLD细胞模型的构建以添加游离脂肪酸（FFAs）最为常见。Gomez-Lechon发现，应用油酸钠、棕榈酸钠含量比为2：1的游离脂肪酸混合物刺激肝细胞，引起的细胞毒性和凋亡作用非常微弱，适用于诱导肝脏细胞脂肪变性。本研究中，应用油酸钠：棕榈酸钠为2:1，总浓度为1mmol/L的高脂培养基刺激Hepa1-6细胞24小时，成功建立了肝脏脂肪变性的细胞模型。
需要说明的是，2：1的游离脂肪酸混合物刺激肝细胞只是普遍做法，而不一定是最优做法，实际情况可以根据细胞类型调整游离脂肪酸的浓度、比例和作用时间。
3.具体步骤
1）细胞的复苏、传代及冻存
将细胞从液氮中取出，迅速放入已预热至37℃的水浴锅中轻轻摇动，直至完全溶解，加入含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，室温下1000 rpm，离心5 min，弃上清，用适量完全培养基重悬，转移至细胞培养瓶/皿中，置于37℃、5%二氧化碳的恒温培养箱中培养。
当细胞生长汇合度达到80%-90%时，弃掉旧培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS） 润洗后弃去，加入胰酶消化细胞。当细胞皱缩变圆时，加入等体积完全培养基终止消化反应，室温下1000 rpm，离心5 min，弃上清，用适量完全培养基重悬，按1:2（或1:3）传代，转移至细胞培养瓶/皿中，置于37℃、5%二氧化碳的恒温培养箱中培养。
选取对数生长期的细胞，弃掉旧培养基，磷酸盐缓冲液（PBS）润洗后弃去，加入胰酶消化细胞。当细胞皱缩变圆时，加入等体积完全培养基终止消化反应，室温下1000 rpm，离心5 min，弃上清，用适量细胞冻存液（FBS：DMSO=1:9）重悬，转移至细胞冻存管中，放入程序降温盒中，置于-80℃冰箱中，24小时后转移至液氮中长期保存。
2）肝脏脂肪变性细胞模型的构建
将Hepa1-6调整为密度1×105/mL的细胞悬液，按照1mL/孔（500uL/孔也可以）接种于12孔板中，置于37℃、5%二氧化碳的恒温培养箱中培养过夜。当培养板中细胞汇合度达到50%-60%时，弃掉旧培养基，加入含FFAs终浓度为1mmol/L（油酸钠：棕榈酸钠=2:1）的DMEM完全培养基，置于37℃、5%二氧化碳的恒温培养箱中培养24小时以构建肝脏脂肪变性细胞模型。对照组中加入含等浓度牛血清白蛋白（BSA）的DMEM完全培养基。
3）细胞油红O染色
使用油红O染色试剂盒（细胞专用）进行细胞油红O染色，具体步骤如下：
（1）弃去培养液，PBS润洗细胞两次，加入油红O固定液固定30min；（2）弃去固定液，蒸馏水清洗细胞两次，加入60%异丙醇溶液浸洗5min；（3）弃去60%异丙醇溶液，加入新配制的油红O染色液，浸染20min；（4）弃去染色液，蒸馏水清洗3次，加入Mayer苏木素染色液，染细胞核1min；（5）弃去染色液，蒸馏水清洗3次，加入油红O缓冲液，静置1min；（6）弃去缓冲液，加入蒸馏水覆盖细胞，在显微镜下观察并拍照。
4）细胞内甘油三酯（TG），总胆固醇（TCHO）测定
使用甘油三酯测定试剂盒、总胆固醇测定试剂盒进行细胞内TG、TCHO测定，使用蛋白定量测定试剂盒进行细胞内蛋白浓度测定。
4．结果分析
用FFAs处理Hepa1-6细胞24小时以构建肝脏脂肪变性细胞模型。油红O染色结果显示，与BSA处理的对照组相比，FFAs组细胞中可见大量红色脂滴（图1）。细胞内脂质测定结果显示，FFAs组细胞内TG、TCHO含量显著高于BSA组。以上结果表明，FFAs诱导的肝脏脂肪变性细胞模型建立成功。
小编有话说：
1）目前，在完全培养基中添加棕榈酸钠和油酸钠时，普遍采用如下两种混合方式：
方式一）精确混合、浓度精确控制
以KC006型高脂细胞添加剂（Kunchuang Biotechnology）为例：
油酸钠工作液：母液浓度12mM→作用浓度0.5mM，稀释了24倍；
棕榈酸钠工作液：母液浓度6mM→作用浓度0.25mM，稀释了24倍；
因此，24份总体积=1份油酸钠工作液（OA）+1份棕榈酸钠工作液（PA）+22份完全培养基。此时，以1.2mL为例，OA加1.2/24=0.05mL，PA加1.2/24=0.05mL，其余为培养基。以1mL为例，OA加1/24=0.0417mL，PA加1.2/24=0.0417mL，其余为培养基。
方式二）1:2整体混合
上述实施例中，游离脂肪酸（PA+OA）的最终浓度为1mM、且油酸钠：棕榈酸钠=2:1。以KC006型高脂细胞添加剂（Kunchuang Biotechnology）为例，直接将独立包装的OA（12mM母液）与PA（6mM母液）等体积混合，此时，得到9mM的FFAs。然后，将9mM的FFAs稀释9倍，即得最终浓度为1mM、且油酸钠：棕榈酸钠=2:1的游离脂肪酸，建议现配现用。
2）本实例的细胞模型中，FFAs组细胞内TG、TCHO含量显著高于BSA组。其中，FFAs组细胞内TCHO含量显著高于BSA组为不常见的情况。现有文献中多数记录了：游离脂肪酸不会显著改变细胞内TCHO含量。因此，该实验结果为FFAs引起细胞内总胆固醇（total cholesterol，TCHO）变化的研究提供了有价值的参考。
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