一、样本制备
1. 细胞样本：吸去细胞培养液，用预冷的PBS清洗细胞2 - 3次。加入适量含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上孵育30分钟，期间可轻轻晃动培养皿。用细胞刮将细胞刮下，转移至离心管，4℃、12000rpm离心15分钟，取上清，BCA法测定蛋白浓度。
2. 组织样本：取适量组织，用预冷PBS冲洗，去除血液等杂质。将组织剪碎，加入裂解液和蛋白酶、磷酸酶抑制剂，使用匀浆器充分匀浆，后续步骤同细胞样本。
二、SDS - PAGE电泳
1. 制胶：根据目标蛋白分子量选择合适的分离胶浓度，如10% - 15%。按比例配制分离胶，加入TEMED和APS后迅速混匀，注入胶板，留出积层胶空间，覆盖一层无水乙醇，待分离胶凝固。倒掉乙醇，用滤纸吸干，配制积层胶，注入后插入梳子，待积层胶凝固。
2. 上样：将蛋白样品与上样缓冲液混合，100℃煮沸5分钟使蛋白变性。取适量蛋白样品加入加样孔，同时加入蛋白Marker作为分子量标准。
3. 电泳：将胶板放入电泳槽，加入电泳缓冲液，接通电源，先80V恒压跑至蛋白进入分离胶，再调至120V恒压，直至溴酚蓝指示剂迁移至胶底部，结束电泳。
三、转膜
1. 准备材料：裁剪与凝胶大小相同的PVDF膜和滤纸，PVDF膜需先在甲醇中浸泡1 - 2分钟活化，然后放入转膜缓冲液中平衡；滤纸也需浸泡在转膜缓冲液中。
2. 组装转膜装置：按照“负极 - 海绵 - 滤纸 - 凝胶 - PVDF膜 - 滤纸 - 海绵 - 正极”的顺序组装，每层之间注意排除气泡。
3. 转膜：将转膜装置放入转膜槽，加入转膜缓冲液，冰浴条件下，300mA恒流转膜60 - 90分钟，或根据目标蛋白分子量调整转膜时间和电流。
四、封闭
转膜结束后，将PVDF膜放入5%脱脂奶粉或BSA封闭液中，室温摇床孵育1 - 2小时，以封闭膜上非特异性结合位点。
五、一抗孵育
将封闭后的膜放入稀释好的一抗溶液中，4℃孵育过夜；或室温摇床孵育2 - 3小时。孵育结束后，用TBST缓冲液洗膜3次，每次10分钟。
六、二抗孵育
将膜放入相应的HRP标记的二抗稀释液中，室温摇床孵育1 - 2小时，使二抗与一抗特异性结合。孵育结束后，用TBST缓冲液洗膜3 - 5次，每次10分钟。
七、显影
1. 配制ECL发光液：按比例混合A液和B液。
2. 发光检测：将PVDF膜从TBST中取出，用滤纸吸去多余液体，滴加ECL发光液，均匀覆盖膜表面，孵育1 - 2分钟，放入化学发光成像仪中曝光成像 。
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